病状《迅速・確定》診断技術

当社はこのたび 広域全反射照明ステージ「Tycho Wide TIRF」を開発いたしました。本装置は光ファイバーを並列化し発光出力部のサイズを 厚み0.1mm x 幅15mm に設計し、厚さ0.17mmの標準カバーグラスの側面からも効率よく幅広い光を導入することが可能となり、観察面の広域において全反射を起こすことができます。

このカバーグラス内の全反射を起因に、トンネル効果によってカバーグラス表面の極近傍(~150nm)にエバネッセント光が発生します(図1)(図2)

この光を励起光として、カバーグラス表面極近傍の蛍光色素のみを光らせます。全反射側面図

図1 全反射模式図(側面図)

全反射上面図

図2 全反射模式図(上面図)

カバーグラス表面に結合させた抗体などを用いて、特異的にたんぱく質やウイルスなどを補足し、蛍光ラベルやプローブを用いて高感度に多種類(~10,000種)を検出することが可能となります。

 

低倍率レンズを用いて広い視野を観察したい場合では、通常、被写界深度が深く、蛍光観察時に深さ方向のノイズを拾ってしまいます。

本技術を用いると、ピントの非常に浅い領域のみ(カバーグラス表面の極近傍のみ)を

観察するため、S/Nの非常に高い画像を得ることが可能となります(図3)(図4)

本技術と高感度プローブを組み合わせることにより、従来観察することが不可能だった1細胞の作り出す分泌物(抗体やたんぱく質など)の定量や、ごく少数のウイルスなどを検出することが可能となります。

被写界深度説明

図3 表面に近接している物体のみ観察が可能

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図4 発光出力部の外観写真

 

<迅速診断装置への応用① ~ウイルス・細菌の網羅的高感度観察~>

子どもは免疫機能が確立しておらず、また、園や学校で集団生活を送る機会も多いため、発熱したりせきが出るというような風邪様の症状が頻繁に起こります。

その際に自宅近くのクリニックに行き、インフルエンザや溶連菌などのいくつかの限られた病気の検査キットを用いて、陽性(+)か陰性(-)の結果により診断を行います。

陽性の場合は決まった薬を用いて治療を行いますが、多くの場合は陰性が出ます。その時、医師は世間で流行している病気の状況や経験に即する見立てで病状を判断します。しかしながら、これがいつも正確な診断であるとは言い切れません。また、上述の検査なども症状が発生してからある程度の時間を経ないと検査キットの検出感度の問題で確定できない場合が多くあります。

 

 

<迅速診断装置への応用② ~救急患者の迅速病状判定>

一人暮らしの年配者が増えることで救急要請(119番通報)が増加することも想像できます。

患者が「胸が苦しい」「右腹部が痛い」など自分で症状を説明できる場合は、駆け付けた救急隊員が初動の対応や検査を行うための最も参考となる情報となりますが、駆け付けた時には、患者が倒れて意識が無いことなども少なくありません。

そのような時に、少量の血液などから血液中のたんぱく質を網羅的に高感度で検出することが可能となると、例えば急性膵炎なのか、心筋梗塞なのかなどが迅速かつ正確に判定をすることが可能となります。

このことにより時間が勝負となる救命救急時の対応(応急処置・病院選び・治療方法・手術)などが的確に行われ、医療の質が向上します。

 

 

<迅速診断装置への応用③ ~アレルゲンや毒素の高感度検出>

大量消費、大量生産時代の昨今、身近にある食品は工場で大量生産されたものがほとんどです。また、穀物や畜産物なども同様に大量生産を行っています。消費需要に対応するためには仕方がないのですが、工場では食品製造の過程で抽出や精製の過程を経ます。その際には溶剤や酸・アルカリ溶液を使用し、最終段階までに除去を行いますが、そのような溶剤などの残留や副産物が体に悪影響を及ぼす可能性は否定できません。また、同様に穀物の残留農薬や、食肉・乳・鶏卵などに含まれる飼料中の各種薬剤も残留している可能性が少なからずとも存在します。

しかしながら、現在の計測技術では極々微量の化合物や元素を検出することに限界があります(fmol~amol:10,000,000~10,000分子以上)

細胞には更に極々微小量(数分子)であっても反応する機能があります。

細胞表面のレセプターたんぱく質に化合物が1分子結合するだけでも反応が起こると考えられます。ある種の昆虫の性ホルモン嗅覚機能などは非常に高感度であることが知られています(2km以上離れたメスを検知する等)

細胞を1個づつマイクロデバイスに並べ、細胞センサーとして検査を用いる事を想定し研究が進められている例もあります。

https://www.jst.go.jp/pr/jst-news/pdf/2015/2015_05_p08.pdf

 

次世代の病状確定診断装置の構想

(2018.11.27~)

上述したような、網羅的検出には各ウイルスや病原菌、マーカーに対しての抗体(モノクローナル抗体:MAb等)を準備する必要があります。

抗体は高等動物の生体内において脾臓内のB細胞がその生産を担っていますが、ある種のウイルスなどに感染して数日経つと、そのウイルスのみに対する(接着してやっつける)抗体が生産されるようになります。これが「免疫」の一役を担っています。

免疫を獲得した動物の脾臓を取り出し、脾臓からB細胞も取り出したのち、容器の中で分散させ、そこにミエローマ(がん細胞)を添加し、薬剤や電気などの刺激を与えると一部のB細胞とミエローマが融合します。これが「ハイブリドーマ」という細胞です。

ハイブリドーマはB細胞の抗体生産能力とミエローマの増殖能力を持ち合わせますが、ハイブリドーマの能力は一個一個の細胞ごとに異なります。

バイオ医薬品や診断用として用いる抗体は、高額な設備や消耗品を用いて開発・製造を行うためその生産性の効率が非常に重要になります。

現状、製薬企業や抗体を製造販売している企業が、優秀なハイブリドーマ(チャンピオン細胞)を得るために行っている手法は「限界希釈法」です(図5)

図5 限界希釈法

この手法はエッペンチューブなどの容器にハイブリドーマが10万個/1ml 入っている状態からそのうちの1/10量である0.1mlを取り出し、別の0.9mlの液体のみ(細胞が入っていない培地など)が入ったエッペンチューブに移すことで1万個/1mlを作り、これを繰り返すことで最終的に1容器に100個/1mLが入ったものができあがります。ここから0.01mlずつ液体を取り出し、96wellプレートの1wellずつに分注していくことで確率論的に1個/1wellが出来上がるというものです。

その後、96wellプレートを1週間ほど培養すると、顕微鏡下でコロニーの形成が確認できるようになり、1個か2個か、はたまた入っていなかったかが判明します。

次に、元々1個だったと思われる各wellから上澄みを採取し、ELISAやウエスタンブロッティング、相互作用解析などを行い、最も抗体の反応性(力価)が高く、生産効率が高いハイブリドーマを選抜していきます。これら1サイクル=約1か月の工程を何サイクルか繰り返し、最終的に1個の細胞を選び出します。

このように、現在のチャンピオン細胞の選抜方法は時間と手間とコストがかかる方法となりますが、1細胞計測と操作技術を用いる事で、数カ月→1~2日 数百万円→数万円にすることが現実となってきました。このことにより、【①多種類の抗体を迅速かつ安価に生産】することが可能となりました。

そのほか、【②高精度微量分注技術】と【③高感度測定技術】を組み合わせることで、(図6)のような検査キットを用いる事が可能となり、従来は余分な検出用プローブを洗浄しなければいけなかった工程も必要がなくなるため、ただサンプルをかけるだけで、わずか数秒で検出することが可能となります。

図6 網羅的・高感度 病状迅速確定診断システムの検査キット概要

この検査キットは(1)感染症エリア(2)急性疾患エリア(3)アレルギーエリア(4)獲得免疫エリア に分かれ、これらを一度に検出します。(2018.11.27)